a cromatografia, também conhecida como "análise cromatográfica", "cromatografia", é um método de separação e análise, que possui uma ampla gama de aplicações em química analítica, química orgânica, bioquímica e outros campos.
O fundador da cromatografia é o botânico russo M.Tsvetter.Em 1906, o botânico russo Zvetter publicou os resultados de seu experimento: Para separar os pigmentos vegetais, ele despejou extrato de éter de petróleo contendo pigmentos vegetais em um tubo de vidro contendo pó de carbonato de cálcio e o eluiu com éter de petróleo de cima para baixo.Como diferentes pigmentos têm diferentes capacidades de adsorção na superfície das partículas de carbonato de cálcio, com o processo de lixiviação, diferentes pigmentos descem em velocidades diferentes, formando assim faixas de cores diferentes.Os componentes do pigmento foram separados.Ele chamou esse método de separação de cromatografia.
Representação esquemática de um experimento de separação de pigmentos de folhas de plantas
Com o desenvolvimento contínuo dos métodos de separação, cada vez mais substâncias incolores tornam-se objeto de separação, a cromatografia também perdeu gradativamente o significado de "cor", mas o nome ainda é usado hoje.
Classificação cromatográfica
A essência da cromatografia é um processo no qual as moléculas a serem separadas são particionadas e equilibradas entre a fase estacionária e a fase móvel.Diferentes substâncias são divididas de forma diferente entre as duas fases, o que as faz mover-se a velocidades diferentes com a fase móvel.Com o movimento da fase móvel, diferentes componentes da mistura são separados uns dos outros na fase estacionária.Dependendo do mecanismo, ele pode ser dividido em diversas categorias.
1, de acordo com a classificação do estado físico de duas fases
Fase móvel: Cromatografia gasosa, cromatografia líquida, cromatografia em fluido supercrítico
Fase estacionária: gás-sólido, gás-líquido;Líquido-sólido, líquido-líquido
2, de acordo com a forma de classificação da fase estacionária
Cromatografia em coluna: cromatografia em coluna compactada, cromatografia em coluna capilar, cromatografia em coluna microcompactada, cromatografia preparativa
Cromatografia plana: cromatografia em papel, cromatografia em camada fina, cromatografia em membrana polimérica
3, classificado de acordo com o mecanismo de separação
Cromatografia de adsorção: Diferentes componentes são separados de acordo com suas capacidades de adsorção e dessorção em adsorventes
Cromatografia de partição: Os diferentes componentes são separados de acordo com sua solubilidade no solvente
Cromatografia de exclusão molecular: de acordo com o tamanho do tamanho molecular da separação Cromatografia de troca iônica: diferentes componentes da afinidade para a separação da resina de troca iônica
Cromatografia de afinidade: Separação utilizando a presença de uma afinidade específica entre macromoléculas biológicas
Eletroforese capilar: os componentes foram separados de acordo com as diferenças de mobilidade e/ou comportamento de partição
A cromatografia quiral é utilizada para a separação e análise de fármacos quirais, que podem ser divididos em três categorias: método de reagente de derivatização quiral;Método aditivo de fase móvel quiral;Método quiral de resolução de fase estacionária
Terminologia básica para cromatografia
As curvas obtidas traçando os sinais de resposta dos componentes após a detecção da separação cromatográfica em função do tempo são chamadas de cromatogramas.
Linha de base:Sob certas condições cromatográficas, a curva do sinal gerado quando apenas a fase móvel passa pelo sistema detector é chamada de linha de base, conforme mostrado na linha ot.Quando a condição experimental era estável, a linha de base era uma linha paralela ao eixo horizontal.A linha de base reflete o ruído do instrumento, principalmente do detector, ao longo do tempo.
Altura do pico:a distância vertical entre o ponto de pico cromatográfico e a linha de base, indicada por h, conforme mostrado na linha AB'.
Largura da região:A largura da região do pico cromatográfico está diretamente relacionada à eficiência de separação.Existem três métodos para descrever a largura do pico cromatográfico: desvio padrão σ, largura do pico W e FWHM W1/2.
Desvio padrão (σ):σ é a meia distância entre os dois pontos de inflexão na curva de distribuição normal, e o valor de σ indica o grau de dispersão dos componentes longe da coluna.Quanto maior o valor de σ, mais dispersos são os componentes do efluente e pior é o efeito de separação.Por outro lado, os componentes do efluente são concentrados e o efeito de separação é bom.
Largura do pico W:Os pontos de intersecção em ambos os lados do pico cromatográfico são usados como linhas tangentes, e a interceptação na linha de base é chamada de largura do pico, ou largura da linha de base, que também pode ser expressa como W, conforme mostrado na Figura IJ.De acordo com o princípio da distribuição normal, pode-se provar que a relação entre a largura do pico e o desvio padrão é W = 4σ.
W1/2:A largura do pico na metade da altura do pico é chamada de FWHM, conforme mostrado para a distância de GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W são ambos derivados de σ e são usados para calcular áreas de pico, além de medir o efeito da coluna.A medição FWHM é mais conveniente e mais comumente usada.
sumário breve
A partir da curva de pico de fluxo cromatográfico, os seguintes objetivos podem ser alcançados:
a, A análise qualitativa foi realizada com base no valor de retenção dos picos cromatográficos
b, análise quantitativa baseada na área ou pico do pico cromatográfico
C. A eficiência de separação da coluna foi avaliada de acordo com o valor de retenção e a largura do pico cromatográfico
A fórmula de cálculo envolvida na cromatografia
1. Valor de retenção
O valor de retenção é um parâmetro usado para descrever o grau em que um componente da amostra é retido na coluna e é usado como um indicador de caracterização cromatográfica.Seu método de representação é o seguinte:
Tempo de retenção tR
Hora da mortetM
Ajuste o tempo de retenção tR'=tR-tM
(Tempo total gasto na fase estacionária)
Volume de retenção
VR=tR*F.(independente da velocidade da fase móvel)
Volume morto
VM=tM*Fc
(O espaço não ocupado pela fase estacionária no caminho do fluxo do injetor ao detector)
Ajuste o volume de retenção VR'=t'R*FC
2. Valor de retenção relativo
O valor de retenção relativo, também conhecido como fator de separação, razão de coeficiente de partição ou fator de capacidade relativo, é a razão entre o tempo de retenção ajustado (volume) do componente testado e o tempo de retenção ajustado (volume) do padrão sob certas condições cromatográficas.
Valores de retenção relativos foram utilizados para eliminar a influência de certas condições operacionais, como vazão e perda de fixador, nos valores de retenção.O padrão no valor de retenção relativo pode ser um componente da amostra testada ou um composto adicionado artificialmente.
3. Índice de retenção
O índice de retenção é o índice de retenção da substância i a ser testada em uma solução fixa X. Dois n-alanos são selecionados como substâncias de referência, um dos quais possui número de carbono N e o outro possui N+n.Seu tempo de retenção ajustado é t 'r (N) e t 'r (N+n), respectivamente, de modo que o tempo de retenção ajustado t 'r (i) da substância i a ser testada esteja exatamente entre eles, ou seja, t'r (N).
O índice de retenção pode ser calculado da seguinte forma.
4. Fator de capacidade (k)
No equilíbrio, a razão entre a massa de um componente na(s) fase(s) estacionária(s) e a fase móvel (m), chamada de fator de capacidade.A fórmula é a seguinte:
5、Coeficiente de partição (K) Em equilíbrio, a razão entre a concentração de um componente na(s) fase(s) estacionária(s) e a fase móvel (m), chamada coeficiente de partição.A fórmula é a seguinte
A relação entre K e k:
Reflete o tipo de coluna e seu nó, propriedades importantes da estrutura
sumário breve
Relação entre valor de retenção e fator de capacidade e coeficiente de partição:
A separação cromatográfica é baseada na diferença na capacidade de adsorção ou dissolução de cada componente em uma amostra relativa fixa, que pode ser expressa quantitativamente pelo tamanho do valor do coeficiente de partição K (ou fator de capacidade k).
Os componentes com forte capacidade de adsorção ou dissolução possuem grande coeficiente de partição (ou fator de capacidade) e longo tempo de retenção.Por outro lado, os componentes com fraca adsorção ou solubilidade apresentam um pequeno coeficiente de partição e um curto tempo de retenção.
Teoria básica da cromatografia
1. Teoria da bandeja
(1) Apresentada - teoria termodinâmica
Tudo começou com o modelo de placa de torre proposto por Martin e Synge.
Coluna de fracionamento: na bandeja por vários tempos de equilíbrio gás-líquido, de acordo com o ponto de ebulição das diferentes separações.
Coluna: Os componentes são balanceados por múltiplas partições entre as duas fases e separados de acordo com diferentes coeficientes de partição.
(2) Hipótese
(1) Existem muitas bandejas na coluna e os componentes podem atingir rapidamente o equilíbrio de distribuição dentro do intervalo da bandeja (ou seja, a altura da bandeja).
(2) A fase móvel entra na coluna, não de forma contínua, mas pulsante, ou seja, cada passagem é um volume da coluna.
(3) Quando a amostra foi adicionada a cada placa da coluna, a difusão da amostra ao longo do eixo da coluna poderia ser desprezada.
(4) O coeficiente de partição é igual em todas as bandejas, independente da quantidade de componentes.Ou seja, o coeficiente de partição é constante em cada taban.
(3) Princípio
Diagrama esquemático da teoria da bandeja
Se um componente de massa unitária, nomeadamente m = 1 (por exemplo, 1 mg ou 1 μg), for adicionado à bandeja nº 0, e após equilíbrio de distribuição, porque k = 1, nomeadamente ns = nm, nm = ns = 0,5.
Quando um volume de placa (lΔV) de gás de arraste entra na placa 0 na forma de pulsação, o gás de arraste contendo o componente nm na fase gasosa é empurrado para a placa 1. Neste momento, o componente ns na fase líquida da placa 0 e o componente nm na fase gasosa da placa 1 será redistribuído entre as duas fases.Portanto, a quantidade total de componentes contidos na placa 0 é 0,5, em que as fases gasosa e líquida são 0,25 cada, e a quantidade total contida na placa 1 também é 0,5.As fases gasosa e líquida também foram 0,25.
Este processo é repetido sempre que um novo gás de arraste com volume de placa é pulsado na coluna (ver tabela abaixo).
(4) Equação da curva de fluxo cromatográfico
σ é o desvio padrão, é o tempo de retenção, C é a concentração a qualquer momento,
C, é a concentração de injeção, ou seja, a quantidade total de componentes (área de pico A).
(5) parâmetros de eficiência da coluna
A um tR constante, quanto menor W ou w 1/2 (ou seja, quanto mais estreito o pico), maior será o número de placas teóricas n, menor será a altura teórica da placa e maior será a eficiência de separação da coluna.O mesmo se aplica à teoria eficaz bandeja neff.Portanto, o número teórico de bandejas é um índice para avaliar a eficiência das colunas.
(5)Características e deficiências
> Vantagens
A teoria da bandeja é semi-empírica e explica a forma da curva de saída
Os processos de particionamento e separação dos componentes são ilustrados
É proposto um índice para avaliar a eficiência da coluna
> Limitações
Os componentes não conseguem realmente atingir o equilíbrio de distribuição nas duas fases:
A difusão longitudinal dos componentes na coluna não pode ser ignorada:
A influência de vários fatores cinéticos no processo de transferência de massa não foi considerada.
A relação entre o efeito da coluna e a velocidade do fluxo da fase móvel não pode ser explicada:
Não está claro quais os principais fatores que afetam o efeito coluna
Esses problemas são resolvidos satisfatoriamente na teoria das taxas.
2. Teoria das taxas
Em 1956, o estudioso holandês VanDeemter et al.absorveu o conceito de teoria da bandeja e combinou os fatores cinéticos que afetam a altura da bandeja, apresentou a teoria cinética do processo cromatográfico - teoria da taxa e derivou a equação de VanDeemter.Considera o processo cromatográfico como um processo dinâmico de desequilíbrio e estuda a influência de fatores cinéticos no alargamento do pico (ou seja, efeito de coluna).
Mais tarde, Giddings e Snyder et al.propôs a equação da taxa de cromatografia líquida (ou seja, equação de Giddings) baseada na equação de VanDeemter (mais tarde chamada de equação da taxa de cromatografia gasosa) e de acordo com a diferença de propriedades entre líquido e gás.
(1) Equação de Van Deemter
Onde: H: é a altura do tabuleiro
A: coeficiente do termo de difusão parasita
B: coeficiente do termo de difusão molecular
C: coeficiente do termo de resistência à transferência de massa
(2) Equação de Giddings
Análise quantitativa e qualitativa
(1) Análise qualitativa
A análise cromatográfica qualitativa consiste em determinar os compostos representados por cada pico cromatográfico.Dado que várias substâncias têm valores de retenção definidos sob certas condições cromatográficas, o valor de retenção pode ser utilizado como um índice qualitativo.Vários métodos qualitativos cromatográficos baseiam-se atualmente em valores de retenção.
Porém, substâncias diferentes podem ter valores de retenção semelhantes ou idênticos nas mesmas condições cromatográficas, ou seja, os valores de retenção não são exclusivos.Assim, é difícil caracterizar uma amostra completamente desconhecida com base apenas nos valores de retenção.Se com base na compreensão da fonte, natureza e finalidade da amostra, um julgamento preliminar da composição da amostra puder ser feito, e os seguintes métodos poderão ser usados para determinar o composto representado pelo pico cromatográfico.
1. Controle qualitativo utilizando substâncias puras
Sob certas condições cromatográficas, um desconhecido tem apenas um tempo de retenção definido.Portanto, o desconhecido pode ser identificado qualitativamente comparando o tempo de retenção da substância pura conhecida sob as mesmas condições cromatográficas com o tempo de retenção da substância desconhecida.Se os dois forem iguais, a substância desconhecida pode ser uma substância pura conhecida;Caso contrário, o desconhecido não é a substância pura.
O método de controle de substância pura só é aplicável à substância desconhecida cuja composição é conhecida, cuja composição é relativamente simples e cuja substância pura é conhecida.
2. Método de valor de retenção relativo
O valor de retenção relativo α refere-se ao ajuste entre o componente i e os materiais de referência. Razão dos valores de retenção:
Só muda com a mudança do fixador e da temperatura da coluna, e não tem nada a ver com outras condições de operação.
A uma determinada fase estacionária e temperatura da coluna, os valores de retenção ajustados do componente i e da substância de referência são medidos respectivamente e depois calculados de acordo com a fórmula acima.Os valores de retenção relativos obtidos podem ser comparados qualitativamente com os valores correspondentes na literatura.
3, adicionando substâncias conhecidas para aumentar o método da altura do pico
Quando há muitos componentes na amostra desconhecida, os picos cromatográficos obtidos são muito densos para serem facilmente identificados pelo método acima, ou quando a amostra desconhecida é usada apenas para a análise do item especificado.
"Primeiro é feito um cromatograma de uma amostra desconhecida e, em seguida, outro cromatograma é obtido adicionando uma substância conhecida à amostra desconhecida."Componentes com alturas de pico aumentadas podem ser conhecidos para tais substâncias.
4. Manter o método qualitativo do índice
O índice de retenção representa o comportamento de retenção de substâncias em fixadores e é atualmente o índice qualitativo mais utilizado e reconhecido internacionalmente em GC.Tem as vantagens de boa reprodutibilidade, padrão uniforme e pequeno coeficiente de temperatura.
O índice de retenção está relacionado apenas às propriedades da fase estacionária e à temperatura da coluna, mas não a outras condições experimentais.Sua precisão e reprodutibilidade são excelentes.Desde que a temperatura da coluna seja igual à da fase estacionária, o valor da literatura pode ser aplicado para identificação, não sendo necessário utilizar o material puro para comparação.
(2)Análise quantitativa
Base para quantificação cromatográfica:
A tarefa da análise quantitativa é encontrar a centena de componentes na amostra mista
Conteúdo fracionário.A quantificação cromatográfica baseou-se no seguinte: quando as condições operacionais eram consistentes, foi
A massa (ou concentração) do componente medido é determinada pelo sinal de resposta dado pelo detector
É proporcional.Nomeadamente:
Base para quantificação cromatográfica:
A tarefa da análise quantitativa é encontrar a centena de componentes na amostra mista
Conteúdo fracionário.A quantificação cromatográfica baseou-se no seguinte: quando as condições operacionais eram consistentes, foi
A massa (ou concentração) do componente medido é determinada pelo sinal de resposta dado pelo detector
É proporcional.Nomeadamente:
1. Método de medição de área de pico
A área do pico são os dados quantitativos básicos fornecidos pelos cromatogramas, e a precisão da medição da área do pico afeta diretamente os resultados quantitativos.Diferentes métodos de medição foram utilizados para picos cromatográficos com diferentes formatos de pico.
É difícil encontrar o valor exato do inverno na análise quantitativa:
Por um lado, devido à dificuldade de medir com precisão o volume absoluto de injeção: por outro lado
A área do pico depende das condições cromatográficas, e a faixa cromatográfica deve ser mantida quando o valor é medido
Não é possível nem conveniente fazer a mesma coisa.E mesmo que você consiga acertar
O valor exato, até porque não existe um padrão unificado e não pode ser aplicado diretamente.
2. Fator de correção quantitativa
Definição de fator de correção quantitativo: quantidade de componentes que entram no detector (m)
A razão entre sua área de pico cromatográfico (A) ou altura de pico () é uma constante de proporcionalidade (,
A constante de proporcionalidade é chamada de fator de correção absoluto do componente.
É difícil encontrar o valor exato do inverno na análise quantitativa:
Por um lado, devido à dificuldade de medir com precisão o volume absoluto de injeção: por outro lado
A área do pico depende das condições cromatográficas, e a faixa cromatográfica deve ser mantida quando o valor é medido
Não é possível nem conveniente fazer a mesma coisa.E mesmo que você consiga acertar
O valor exato, até porque não existe um padrão unificado e não pode ser aplicado diretamente.
Ou seja, o fator de correção relativo 'de um componente é o componente e o material de referência
A proporção dos fatores de correção absolutos.
Pode-se observar que o fator de correção relativo é quando a qualidade do componente versus o padrão.
Quando a substância s é igual, a área do pico do material de referência é a área do pico do componente
Múltiplo.Se algum componente tiver massa m e área de pico A, então o número de f'A
Os valores são iguais à área do pico do material de referência com massa de.Em outras palavras,
Através do fator de correção relativo, as áreas de pico de cada componente podem ser separadas
Convertido para a área do pico do material de referência igual à sua massa, então a razão
O padrão é unificado.Portanto, este é o método normalizado para descobrir a porcentagem de cada componente
A base da quantidade.
Método de obtenção do fator de correção relativo: os valores do fator de correção relativo foram comparados apenas com o valor
A medição está relacionada ao padrão e ao tipo de detector, mas à faixa de operação
Não importa.Portanto, os valores podem ser recuperados de referências na literatura.Se o texto
Se você não conseguir encontrar o valor desejado na oferta, também poderá determiná-lo sozinho.Método de determinação
Método: Uma certa quantidade da substância medida dez materiais de referência selecionados → transformados em uma certa concentração
As áreas dos picos cromatográficos A e As dos dois componentes foram medidas.
Essa é a fórmula.
3. Método de cálculo quantitativo
(1) Método de normalização de área
A soma do conteúdo de todas as frações livres de pico foi calculada como 100% para quantificação
O método é chamado de normalização.Sua fórmula de cálculo é a seguinte:
Onde P,% é o teor percentual dos componentes testados;A1, A2... A n é o componente 1.A área do pico de 1~n;f'1, f'2... f'n é o fator de correção relativo para os componentes 1 a n.
(2) método padrão externo
O método de comparação quantitativa entre o sinal de resposta do componente a ser testado na amostra e o componente puro a ser testado como controle.
(3) Método padrão interno
O chamado método de padrão interno é um método em que uma certa quantidade de substância pura é adicionada à solução padrão da substância testada e à solução amostral como padrão interno, e então analisada e determinada.
(3) método de adição padrão
O método de adição padrão, também conhecido como método de adição interna, consiste em adicionar uma certa quantidade de (△C)
A referência da substância teste foi adicionada à solução amostral a ser testada, e o teste foi adicionado ao ensaio
O pico da solução da amostra após a substância ser maior do que o da solução da amostra original
O incremento de área (△A) foi utilizado para calcular a concentração da substância na solução amostral
Conteúdo (Cx)
Onde Ax é a área do pico da substância a ser medida na amostra original.
Horário da postagem: 27 de março de 2023