Princípios e Métodos de Análise Quantitativa por Cromatografia Líquida

O mecanismo de separação da cromatografia líquida é baseado na diferença de afinidade dos componentes da mistura pelas duas fases.

De acordo com as diferentes fases estacionárias, a cromatografia líquida é dividida em cromatografia líquido-sólido, cromatografia líquido-líquida e cromatografia em fase ligada.As mais utilizadas são a cromatografia líquido-sólido com sílica gel como carga e a cromatografia em fase ligada com microssílica como matriz.

De acordo com a forma da fase estacionária, a cromatografia líquida pode ser dividida em cromatografia em coluna, cromatografia em papel e cromatografia em camada delgada.De acordo com a capacidade de adsorção, pode ser dividida em cromatografia de adsorção, cromatografia de partição, cromatografia de troca iônica e cromatografia de permeação em gel.

Nos últimos anos, um sistema de fluxo líquido de alta pressão foi adicionado ao sistema de cromatografia em coluna líquida para fazer a fase móvel fluir rapidamente sob alta pressão para melhorar o efeito de separação, de modo que a cromatografia líquida de alta eficiência (também conhecida como alta pressão) emergiu.

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01 Princípio de Análise Quantitativa de Cromatografia Líquida

Para quantificar com base na qualidade, são necessárias substâncias puras como padrões;

A quantificação por cromatografia líquida é um método relativamente quantitativo: isto é, a quantidade do analito na mistura é estimada a partir de uma quantidade conhecida de amostra padrão pura.

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02 Base para Quantificação por Cromatografia Líquida

A quantidade do componente medido (W) é proporcional ao valor de resposta (A) (altura do pico ou área do pico), W=f×A.

Fator de correção quantitativa (f): É a constante de proporcionalidade da fórmula de cálculo quantitativo, e seu significado físico é a quantidade do componente medido representado pelo valor de resposta unitária (área de pico).

O fator de correção quantitativo pode ser obtido a partir da quantidade conhecida de amostra padrão e seu valor de resposta.

Meça o valor de resposta do componente desconhecido, e a quantidade do componente pode ser obtida pelo fator de correção quantitativo.

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03 Termos comuns em análise quantitativa

Amostra (amostra): solução contendo um analito para análise cromatográfica.Dividido em amostras padrão e desconhecidas.

Padrão: Produto puro com concentração conhecida.Amostra desconhecida (desconhecida): A mistura cuja concentração deve ser testada.

Peso da amostra: A pesagem original da amostra a ser testada.

Diluição: O fator de diluição da amostra desconhecida.

Componente: o pico cromatográfico a ser analisado quantitativamente, ou seja, o analito cujo conteúdo é desconhecido.

Quantidade do componente (quantidade): o conteúdo (ou concentração) da substância a ser testada.

Integeridade: O processo computacional de medição da área do pico de um pico cromatográfico por um computador.

Curva de calibração: Uma curva linear do conteúdo do componente versus valor de resposta, estabelecida a partir de uma quantidade conhecida de substância padrão, usada para determinar o conteúdo desconhecido do analito.

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04 Análise Quantitativa de Cromatografia Líquida

1. Selecione um método cromatográfico adequado para análise quantitativa:

l Confirme o pico do componente detectado e obtenha uma resolução (R) superior a 1,5

l Determine a consistência (pureza) dos picos cromatográficos dos componentes testados

l Determinar o limite de detecção e o limite de quantificação do método;sensibilidade e faixa linear

2. Estabeleça uma curva de calibração com amostras padrão de diferentes concentrações

3. Verifique a exatidão e precisão dos métodos quantitativos

4. Use o software de gerenciamento de cromatografia correspondente para implementar a coleta de amostras, processamento de dados e resultados de relatórios

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05 Identificação de picos quantitativos (qualitativos)

Identifique qualitativamente cada pico cromatográfico a ser quantificado

Primeiro, utilize a amostra padrão para determinar o tempo de retenção (Rt) do pico cromatográfico a ser quantificado.Comparando o tempo de retenção, encontre o componente correspondente a cada pico cromatográfico na amostra desconhecida.O método qualitativo cromatográfico consiste em comparar o tempo de retenção com a amostra padrão.O critério Insuficienteconfirmação adicional (qualitativa)

1. Método de adição padrão

2. Use outros métodos ao mesmo tempo: outros métodos cromatográficos (alterar o mecanismo, como: usar diferentes colunas cromatográficas), outros detectores (PDA: comparação de espectro, pesquisa de biblioteca de espectro; MS: análise de espectro de massa, pesquisa de biblioteca de espectro)

3. Outros instrumentos e métodos

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06 Confirmação da Consistência Quantitativa do Pico

Confirme a consistência do pico cromatográfico (pureza)

Certifique-se de que haja apenas um componente medido sob cada pico cromatográfico

Verifique se há interferência de substâncias coeluentes (impurezas)

Métodos para confirmação da consistência do pico cromatográfico (pureza)

Comparando espectrogramas com detectores de matriz de fotodiodo (PDA)

Identificação de Pureza Máxima

Teoria do Ângulo de Pureza 2996

Métodos quantitativos comumente usados ​​na PARTE 07

Método da curva padrão, dividido em método padrão externo e método padrão interno:

1. Método padrão externo: mais utilizado em cromatografia líquida

Uma série de amostras padrão de concentrações conhecidas foi preparada utilizando amostras puras dos compostos a serem testados como amostras padrão.injetado na coluna até seu valor de resposta (área de pico).
Dentro de uma certa faixa, existe uma boa relação linear entre a concentração da amostra padrão e o valor de resposta, ou seja, W = f×A, e uma curva padrão é feita.

Exatamente nas mesmas condições experimentais, injete a amostra desconhecida para obter o valor de resposta do componente a ser medido.De acordo com o coeficiente f conhecido, pode-se obter a concentração do componente a ser medido.

As vantagens do método padrão externo:operação e cálculo simples, é um método quantitativo comumente usado;não há necessidade de detectar e eluir cada componente;é necessária uma amostra padrão;as condições de medição da amostra padrão e da amostra desconhecida devem ser consistentes;o volume de injeção deve ser preciso.

Desvantagens do método padrão externo:As condições experimentais devem ser altas, como a sensibilidade do detector, a vazão e a composição da fase móvel não podem ser alteradas;o volume de cada injeção deve ter boa repetibilidade.

2. Método padrão interno: preciso, mas problemático, mais usado em métodos padrão

Uma quantidade conhecida do padrão interno é adicionada ao padrão para formar um padrão misto, e uma série de padrões de trabalho de concentração conhecida é preparada.A razão molar do padrão para o padrão interno no padrão misto permanece inalterada.Injete na coluna cromatográfica e tome (área de pico de amostra padrão/área de pico de amostra padrão interno) como valor de resposta.De acordo com a relação linear entre o valor de resposta e a concentração do padrão de trabalho, nomeadamente W = f×A, é feita uma curva padrão.

Uma quantidade conhecida de padrão interno é adicionada à amostra desconhecida e injetada na coluna para obter o valor de resposta do componente a ser medido.De acordo com o coeficiente f conhecido, pode-se obter a concentração do componente a ser medido.

As características do método padrão interno:Durante a operação, a amostra e o padrão interno são misturados e injetados na coluna cromatográfica, de modo que, desde que a relação entre a quantidade do componente medido e o padrão interno na solução misturada seja constante, a alteração do volume da amostra não afetará os resultados quantitativos..O método do padrão interno compensa a influência do volume da amostra e até mesmo da fase móvel e do detector, por isso é mais preciso que o método do padrão externo.

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08 Fatores que afetam os resultados da análise quantitativa

A baixa precisão pode ser causada por:

Integração incorreta da área do pico, decomposição da amostra ou impurezas introduzidas durante a preparação da amostra, frasco da amostra não selado, volatilização da amostra ou do solvente, preparação incorreta da amostra, problemas de injeção da amostra, preparação incorreta do padrão interno

Possíveis razões para baixa precisão:

Integração de pico incorreta, problemas de injeção ou injetor, decomposição da amostra ou impurezas introduzidas durante a preparação da amostra, problemas cromatográficos, resposta degradada do detector