A cromatografia líquida é o principal método para testar o conteúdo de cada componente e impurezas em matérias-primas, intermediários, preparações e materiais de embalagem, mas muitas substâncias não possuem métodos padrão nos quais confiar, por isso é inevitável desenvolver novos métodos. No desenvolvimento de métodos de fase líquida, a coluna cromatográfica é o núcleo da cromatografia líquida, portanto, escolher uma coluna cromatográfica adequada é crucial. Neste artigo, o autor explicará como escolher uma coluna de cromatografia líquida a partir de três aspectos: ideias gerais, considerações e escopo de aplicação.
A. Ideias gerais para selecionar colunas de cromatografia líquida
1. Avalie as propriedades físicas e químicas do analito: como estrutura química, solubilidade, estabilidade (como se é fácil de ser oxidado/reduzido/hidrolisado), acidez e alcalinidade, etc., especialmente a estrutura química é a chave fator na determinação das propriedades, como o grupo conjugado tem forte absorção ultravioleta e forte fluorescência;
2. Determinar o objetivo da análise: se são necessárias alta separação, alta eficiência da coluna, curto tempo de análise, alta sensibilidade, alta resistência à pressão, longa vida útil da coluna, baixo custo, etc.;
- Escolha uma coluna cromatográfica adequada: entenda a composição, propriedades físicas e químicas do enchimento cromatográfico, como tamanho de partícula, tamanho de poro, tolerância à temperatura, tolerância ao pH, adsorção do analito, etc.
- Considerações para selecionar colunas de cromatografia líquida
Este capítulo discutirá os fatores a serem considerados ao selecionar uma coluna cromatográfica da perspectiva das propriedades físicas e químicas da própria coluna cromatográfica. 2.1 Matriz de preenchimento
2.1.1 Matriz de sílica gel A matriz de enchimento da maioria das colunas de cromatografia líquida é sílica gel. Este tipo de carga possui alta pureza, baixo custo, alta resistência mecânica e é fácil de modificar grupos (como ligação fenil, ligação amino, ligação ciano, etc.), mas o valor de pH e a faixa de temperatura que tolera são limitados: o A faixa de pH da maioria dos enchimentos de matriz de sílica gel é de 2 a 8, mas a faixa de pH de fases ligadas de sílica gel especialmente modificadas pode ser tão ampla quanto 1,5 a 10, e também há fases ligadas de sílica gel especialmente modificadas que são estáveis em pH baixo, como Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, que é estável em pH 1 a 8; o limite superior de temperatura da matriz de sílica gel é geralmente de 60 ℃, e algumas colunas de cromatografia podem tolerar uma temperatura de 40 ℃ em pH alto.
2.1.2 Matriz polimérica As cargas poliméricas são principalmente poliestireno-divinilbenzeno ou polimetacrilato. Suas vantagens são que podem tolerar uma ampla faixa de pH – podem ser usados na faixa de 1 a 14, e são mais resistentes a altas temperaturas (podem atingir acima de 80 °C). Comparado com os enchimentos C18 à base de sílica, este tipo de enchimento tem hidrofobicidade mais forte e o polímero macroporoso é muito eficaz na separação de amostras como proteínas. Suas desvantagens são que a eficiência da coluna é menor e a resistência mecânica é mais fraca do que a das cargas à base de sílica. 2.2 Formato das partículas
A maioria dos enchimentos de HPLC modernos são partículas esféricas, mas às vezes são partículas irregulares. Partículas esféricas podem fornecer menor pressão da coluna, maior eficiência da coluna, estabilidade e vida útil mais longa; ao usar fases móveis de alta viscosidade (como ácido fosfórico) ou quando a solução da amostra é viscosa, as partículas irregulares têm uma área superficial específica maior, o que é mais propício à ação completa das duas fases, e o preço é relativamente baixo. 2.3 Tamanho das partículas
Quanto menor o tamanho da partícula, maior será a eficiência da coluna e maior será a separação, mas pior será a resistência à alta pressão. A coluna mais comumente usada é a coluna com tamanho de partícula de 5 μm; se o requisito de separação for alto, um enchimento de 1,5-3 μm pode ser selecionado, o que conduz à resolução do problema de separação de algumas matrizes complexas e amostras multicomponentes. UPLC pode usar enchimentos de 1,5 μm; Enchimentos com tamanho de partícula de 10 μm ou maior são frequentemente usados para colunas semi-preparativas ou preparativas. 2.4 Conteúdo de carbono
O teor de carbono refere-se à proporção da fase ligada na superfície do gel de sílica, que está relacionada à área superficial específica e à cobertura da fase ligada. O alto teor de carbono proporciona alta capacidade de coluna e alta resolução, e é frequentemente usado para amostras complexas que requerem alta separação, mas devido ao longo tempo de interação entre as duas fases, o tempo de análise é longo; colunas cromatográficas com baixo teor de carbono têm um tempo de análise mais curto e podem apresentar diferentes seletividades, sendo frequentemente utilizadas para amostras simples que requerem análise rápida e amostras que requerem condições de fase aquosa elevada. Geralmente, o teor de carbono do C18 varia de 7% a 19%. 2.5 Tamanho dos poros e área superficial específica
Os meios de adsorção de HPLC são partículas porosas e a maioria das interações ocorre nos poros. Portanto, as moléculas devem entrar nos poros para serem adsorvidas e separadas.
O tamanho dos poros e a área superficial específica são dois conceitos complementares. Tamanho de poro pequeno significa grande área de superfície específica e vice-versa. Uma grande área de superfície específica pode aumentar a interação entre as moléculas da amostra e as fases ligadas, melhorar a retenção, aumentar o carregamento da amostra e a capacidade da coluna e a separação de componentes complexos. Enchimentos totalmente porosos pertencem a este tipo de enchimento. Para aqueles com altos requisitos de separação, recomenda-se escolher enchimentos com grande área superficial específica; uma pequena área de superfície específica pode reduzir a contrapressão, melhorar a eficiência da coluna e reduzir o tempo de equilíbrio, o que é adequado para análise de gradiente. Os enchimentos core-shell pertencem a este tipo de enchimentos. Com a premissa de garantir a separação, recomenda-se a escolha de cargas com pequena área superficial específica para aqueles com requisitos de alta eficiência de análise. 2.6 Volume de poros e resistência mecânica
O volume de poros, também conhecido como “volume de poros”, refere-se ao tamanho do volume vazio por unidade de partícula. Pode refletir bem a resistência mecânica do enchimento. A resistência mecânica de cargas com grande volume de poros é ligeiramente mais fraca do que a de cargas com pequeno volume de poros. Enchimentos com volume de poros menor ou igual a 1,5 mL/g são usados principalmente para separação por HPLC, enquanto enchimentos com volume de poros superior a 1,5 mL/g são usados principalmente para cromatografia de exclusão molecular e cromatografia de baixa pressão. 2.7 Taxa de limite
O capeamento pode reduzir os picos de cauda causados pela interação entre compostos e grupos silanol expostos (como ligação iônica entre compostos alcalinos e grupos silanol, forças de van der Waals e ligações de hidrogênio entre compostos ácidos e grupos silanol), melhorando assim a eficiência da coluna e o formato do pico . Fases ligadas não tampadas produzirão seletividades diferentes em relação às fases ligadas tampadas, especialmente para amostras polares.
- Escopo de aplicação de diferentes colunas de cromatografia líquida
Este capítulo descreverá o escopo de aplicação de diferentes tipos de colunas de cromatografia líquida em alguns casos.
3.1 Coluna cromatográfica C18 de fase reversa
A coluna C18 é a coluna de fase reversa mais comumente usada, que pode atender aos testes de conteúdo e impureza da maioria das substâncias orgânicas e é aplicável a substâncias polares médias, fracamente polares e apolares. O tipo e a especificação da coluna cromatográfica C18 devem ser selecionados de acordo com os requisitos específicos de separação. Por exemplo, para substâncias com elevados requisitos de separação, são frequentemente utilizadas especificações de 5 μm*4,6 mm*250 mm; para substâncias com matrizes de separação complexas e polaridade semelhante, podem ser utilizadas especificações de 4 μm*4,6 mm*250 mm ou tamanhos de partículas menores. Por exemplo, o autor usou uma coluna de 3 μm*4,6 mm*250 mm para detectar duas impurezas genotóxicas no API do celecoxib. A separação das duas substâncias pode chegar a 2,9, o que é excelente. Além disso, sob a premissa de garantir a separação, se for necessária uma análise rápida, muitas vezes é selecionada uma coluna curta de 10 mm ou 15 mm. Por exemplo, quando o autor utilizou LC-MS/MS para detectar uma impureza genotóxica no API de fosfato de piperaquina, foi utilizada uma coluna de 3 μm*2,1 mm*100 mm. A separação entre a impureza e o componente principal foi de 2,0, e a detecção de uma amostra pode ser concluída em 5 minutos. 3.2 Coluna fenil de fase reversa
A coluna fenil também é um tipo de coluna de fase reversa. Este tipo de coluna possui forte seletividade para compostos aromáticos. Se a resposta dos compostos aromáticos medida pela coluna C18 comum for fraca, você pode considerar a substituição da coluna de fenil. Por exemplo, quando eu estava produzindo API de celecoxib, a resposta do componente principal medida pela coluna de fenil do mesmo fabricante e com a mesma especificação (todos 5 μm*4,6 mm*250 mm) foi cerca de 7 vezes maior que a da coluna C18. 3.3 Coluna de fase normal
Como um complemento eficaz à coluna de fase reversa, a coluna de fase normal é adequada para compostos altamente polares. Se o pico ainda for muito rápido ao eluir com mais de 90% de fase aquosa na coluna de fase reversa, e mesmo próximo e sobreposto ao pico do solvente, você poderá considerar a substituição da coluna de fase normal. Este tipo de coluna inclui coluna hilic, coluna amino, coluna ciano, etc.
3.3.1 Coluna hílica A coluna hílica geralmente incorpora grupos hidrofílicos na cadeia alquila ligada para melhorar a resposta a substâncias polares. Este tipo de coluna é adequada para a análise de substâncias açucaradas. O autor utilizou esse tipo de coluna ao fazer o conteúdo e substâncias relacionadas da xilose e seus derivados. Os isómeros de um derivado de xilose também podem ser bem separados;
3.3.2 Coluna amino e coluna ciano Coluna amino e coluna ciano referem-se à introdução de modificações amino e ciano no final da cadeia alquílica ligada, respectivamente, para melhorar a seletividade para substâncias especiais: por exemplo, a coluna amino é uma boa escolha para a separação de açúcares, aminoácidos, bases e amidas; A coluna ciano apresenta melhor seletividade na separação de substâncias estruturais semelhantes hidrogenadas e não hidrogenadas devido à presença de ligações conjugadas. A coluna amino e a coluna ciano muitas vezes podem ser trocadas entre a coluna de fase normal e a coluna de fase reversa, mas a troca frequente não é recomendada. 3.4 Coluna quiral
A coluna quiral, como o nome sugere, é adequada para a separação e análise de compostos quirais, principalmente na área farmacêutica. Este tipo de coluna pode ser considerado quando colunas convencionais de fase reversa e de fase normal não conseguem a separação de isômeros. Por exemplo, o autor usou uma coluna quiral de 5 μm*4,6 mm*250 mm para separar os dois isômeros de 1,2-difeniletilenodiamina: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilenodiamina e (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilenodiamina, e a separação entre os dois atingiu cerca de 2,0. No entanto, as colunas quirais são mais caras do que outros tipos de colunas, geralmente 1W+/peça. Caso haja necessidade de tais colunas, a unidade precisa fazer um orçamento suficiente. 3.5 Coluna de troca iônica
As colunas de troca iônica são adequadas para a separação e análise de íons carregados, como íons, proteínas, ácidos nucléicos e algumas substâncias açucaradas. De acordo com o tipo de enchimento, eles são divididos em colunas de troca catiônica, colunas de troca aniônica e colunas de troca catiônica forte.
As colunas de troca catiônica incluem colunas à base de cálcio e à base de hidrogênio, que são principalmente adequadas para a análise de substâncias catiônicas, como aminoácidos. Por exemplo, o autor utilizou colunas à base de cálcio ao analisar gluconato de cálcio e acetato de cálcio em uma solução de lavagem. Ambas as substâncias tiveram respostas fortes em λ=210 nm, e o grau de separação atingiu 3,0; o autor usou colunas baseadas em hidrogênio ao analisar substâncias relacionadas à glicose. Várias substâncias importantes relacionadas – maltose, maltotriose e frutose – apresentaram alta sensibilidade sob detectores diferenciais, com um limite de detecção tão baixo quanto 0,5 ppm e um grau de separação de 2,0-2,5.
As colunas de troca aniônica são principalmente adequadas para a análise de substâncias aniônicas, como ácidos orgânicos e íons halogênio; colunas de troca catiônica fortes têm maior capacidade e seletividade de troca iônica e são adequadas para a separação e análise de amostras complexas.
O texto acima é apenas uma introdução aos tipos e faixas de aplicação de várias colunas comuns de cromatografia líquida, combinadas com a experiência do próprio autor. Existem outros tipos especiais de colunas cromatográficas em aplicações reais, como colunas cromatográficas de poros grandes, colunas cromatográficas de poros pequenos, colunas de cromatografia de afinidade, colunas cromatográficas multimodo, colunas de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC), colunas de cromatografia de fluido supercrítico ( SFC), etc. Eles desempenham um papel importante em diferentes campos. O tipo específico de coluna cromatográfica deve ser selecionado de acordo com a estrutura e propriedades da amostra, requisitos de separação e outros fins.
Horário da postagem: 14 de junho de 2024